Сельскохозяйственная биотехнология-стр.209

Синтез запасных белков имеет жесткую регуляцию: гены экспрессируются только в единственной ткани (проламины злаков только в эндосперме зерна) и в течение короткого периода развития зерна. Чем же это достигается? Для изучения механизма тканеспецифической и временной экспрессии генов используют так называемый делиционный анализ, который предполагает вырезание различных фрагментов гена, с тем чтобы определить значимость того или иного фрагмента для функционирования целого гена. Так, методом делиционного анализа было показано, что именно 25-нуклеотидная последовательность эндосперм-бокса стимулирует экспрессию генов запасных белков в эндосперме зерна. Более того, было показано, что продукт любого гена, перед которым находится последователь ность эндосперм-бокса, синтезируется только в семенах или зернах.

Таким образом было определено значение этой 25-нуклео-тидной последовательности для синтеза запасных белков, а также необходимость включения ее в состав трансформационных векторов, содержащих модифицированную последовательность генов проламиновых белков с целью их последующего депонирования в семенах или зернах.

Рассмотрим следующий этап в получении трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка на примере модифицированного а-зеина кукурузы. Дополнительные кодоны в последовательность гена вводили с помощью олиго-нуклеотиднаправленного мутагенеза. Впервые такая работа была проведена по введению кодонов лизина в последовательность гена, и как раз на гене а-зеина. Теперь такое введение новых триплетов является довольно обычным.

После модификации нуклеотидной последовательности гена а-зеина следовало соединение всех частей в вектор для трансформации. Это осуществлялось с использованием рестриктаз, вырезающих необходимые фрагменты гена, в нашем случае модифицированного гена а-зеина, из клона геномной библиотеки, и промотора, в данном случае это промотор р-фазолинового гена. Кроме того, в состав конструкции входила последовательность эндосперм-бокса. Соединение этих фрагментов ДНК и клонирование в вектор происходило с использованием ДНК-лигазы.

Другие материалы

Сельскохозяйственная биотехнология-стр.217

Получение растений, устойчивых к гербицидам методами генной инженерии, прежде всего основывается на изучении механизмов толерантности и включает следующие этапы; выявление мишеней действия гербицидов в клетке растений, отбор растений, устойчивых к данному гербициду в качестве источника генов резистентности, идентификация и клонирование этих генов, изучение их экспрессии для использования в трансгенных конструкциях.

В большинстве случаев биохимической мишенью действия гербицидов являются физиологические процессы - фотосинтез или биосинтез аминокислот.